Перевод научной статьи, которая отлично подойдет для реферата или иной научной работы.

BPI (бактерицидный/увеличивающий проницаемость) – мощный антимикробный белок, недавно описанный как белок экспрессирующийся в качестве поверхностного белка на эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта. В этой работе мы исследовали резистентность Vibrio cholerae – патогена тонкого кишечника, который вызывает холеру, к полученному BPI пептиду, Р2. В отличие от Escherichia coli и Salmonella enterica серовар Typhimurium, устойчивость к Р2 у V. cholerae не зависит от BipA GTFазы. Взамен мы обнаружили, что ToxR – мастер-регулятор патогенности V. cholerae, контролирует резистентность к Р2 регуляцией продукции белка наружной мембраны OmpU. Оба – toxR и оmpU мутанты не менее чем в 100 раз чувствительнее к Р2 чем исходный тип клеток. OmpU также сообщает резистентность к полимиксин В сульфату; возможно, что этот порин может сообщать резистентность к катионным антимикробным белкам за счет простого механизма. Исследование клеток в стационарной фазе показало, что ToxR репрессируемый порин OmpТ может также способствовать резистентности к Р2. Наконец, хотя механизм порин-опосредованной резистентности к антимикробным пептидам остается неуловимым, наши данные предполагают, что чувствительность к BPI пептиду OmpU дефицитных V. cholerae не относится вообще к дефектности наружной мембраны.

Извитые грамотрицательные бактерии V. cholerae являются причиной холеры, серьезного и потенциально летального диарейного заболевания. Люди становятся инфицированными этими бактериями вследствие проглатывания зараженной пищи или воды. После пассажа через желудочный барьер V. cholerae колонизируют тонкий кишечник, участок относительно непермиссивный для бактериального роста. В пределах тонкого кишечника V. cholerae секретируют холерный токсин. Активность этого токсина основная причина клинических проявлений холеры. Факт того, что V. cholerae способны к колонизации тонкого кишечника человека предполагает, что эти бактерии имеют механизмы для противодействия кишечным защитным механизмам.

Человеческий кишечник, обладающий особым типом врожденной защиты для отражения инвазивных микроорганизмов, включает: желудочную кислоту, перистальтику, муцин и антимикробные пептиды (АР). АР как предполагают, защищают тонкий кишечник от различных микроорганизмов. Например: человеческий бета-дефензин 5 секретируемый криптическими клетками кишечника и являющийся критическим для защиты хозяина от бактериальной агрессии. BPI – антимикробный белок, который необходим для защиты от грамнегативных патогенов. BPI – 55-60 кДа катионный белок находящийся в нейтрофильных азурофильных гранулах и на клеточной поверхности нейтрофилов. Он так же, как недавно было сообщено, экспрессируется как поверхностный белок на эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта человека. BPI действует специфически на грамнегативные бактерии свойством своего высокого сродства к липиду А – части липополисахарида (LPS). Он играет особую роль в защите хозяина, и эта особая функция была картирована на различных регионах белка. Он обладает катионным N-терминальным регионом, вовлеченным в антибактериальную и эндотоксиннейтрализующую активность, и С-терминальным регионом необходимым для бактериальной опсонизации. Функциональные картирующие исследования установили, что пептид, содержащий BPI остатки от 85 до 99, существенно поддерживает антибактериальную активность. Этот регион образует амфипатический бета-оборот и связи с LPS. Это предполагает, что BPI и Р2 пептиды, которые содержат BPI остатки от 86 до 104, могут использовать тот же самый механизм для убийства Escherichia coli, так как обои увеличивают проницаемость наружной мембраны (НМ) для гидрофобных компонентов и ингибируют потребление О2. Цитотоксический механизм BPI остается плохо изученным. Связывание BPI с LPS вытесняет ионы Ca и Mg, которые в норме образуют мостики с соседними отрицательно заряженными молекулами LPS, и таким образом пертурбирует их правильное расположение, ведя к проницаемости мембраны к малым гидрофобным молекулам. Освобождение двухвалентных ионов, необходимое для активации бактериальных фосфолипаз, ведет к мембранным разрывам. Также полагают, что BPI может повреждать цитоплазматическую мембрану клеток-мишеней.

Бактерия имеет особые стратегии для противостояния АР. Они включают модификацию LPS, мишени АР; выработку экстрацеллюларных протеаз для расщепления АР; активно действующие поточные насосы для экспорта АР за пределы клетки. Другой механизм резистентности, по-видимому, предполагает толерантность к BPI у E. coli и Salmonella spp., что опосредовалось отчасти bipA. bipA мутантные клетки E. coli в 100 раз чувствительнее к BPI пептиду, чем исходный тип (wt) клеток. BipA – GTPаза как предполагают необходима для защиты клеток в стационарной фазе при BPI индуцированном цитоплазматическом повреждении.

Патогенность V. cholerae регулируется ToxR. Этот транскрипционный регулятор контролирует экспрессию группы – не менее 60 – генов (ToxR-регулон), которые кодируют продукты, чья функция – способствовать колонизации кишечника, продукции токсина и выживанию внутри хозяина. ToxR-регулон организован в две ветви. В первой, ToxR работает как коактиватор вместе с другим ДНК-связанным белком, ТсрР, активируя транскрипцию toxT. ТохТ непосредственно способствует продукции холерного токсина и пилей – колонизационного фактора, ТСР, также как и других факторов вирулентности. В другой ветви, которая независит от ToxТ, ToxR позитивно регулирует экспрессию гена ompU, кодирующего белок НМ (ОМР) OmpU и негативно регулирует экспрессию ompT. Продукция OmpТ также контролируется рецепторным белком цАМФ (CRP). CRP – глобальный регулятор, который активирует экспрессию ompT в карбон- и энерголимитированных условиях. Следовательно, OmpТ экспрессируется в стационарно-фазной культуре V. cholerae.

OmpU и OmpТ – порины, которые образуют гидрофильные каналы через НМ. Они как предполагают, функционируют главным образом как каналы входа и выхода гидрофильных молекул низкой молекулярной массы (< 600 кДа). У рода Vibrio, ОМР функционируют как порины для Fe, фосфатов и сахарного транспорта и для прикрепления к неорганической поверхности, хотя их роль в адгезии к хозяйскому эпителию остается контрверсией. ОМР V. cholerae может играть некоторую роль в патогенности. OmpU опосредует резистентность к желчи и анионным детергентам, таким как додецил сульфат, тогда как OmpТ увеличивает чувствительность к анионным детергентам.

Сделанные ранее предположения, что BPI может способствовать врожденной защите желудочно-кишечного тракта, мы исследовали чувствительность V. cholerae к BPI полученному пептиду Р2.

Дискуссия

Мы обнаружили, что ToxR, мастер-регулятор патогенности V. cholerae, также регулирует резистентность этого кишечного патогена к BPI полученному пептиду, важному эффектору врожденной иммунности. ToxR опосредованный контроль резистентности к Р2 в лог-фазе клеток не зависел от ТохТ, а взамен опосредовался ToxR активацией экспрессии OmpU, главного порина V. cholerae. Так как BPI предполагает наличие на внутренней поверхности эпителия большей части ЖКТ, ToxR активация OmpU-экспрессии в процессе роста in vivo может способствовать кишечной колонизации. В то время как сообщалось, что OmpU не увеличивал кишечную колонизацию у мышей-сосунков, и не предполагалось наличие BPI в ЖКТ мышей-сосунков. Поэтому, вероятно, что этот порин играет роль в кишечной колонизации V. cholerae у людей.

Предыдущие исследования не вовлекали порины в резистентность к BPI, но эта работа показала, что у V. cholerae тотальное клеточное содержание OmpU и OmpТ наименее причастно к детерминированию резистентности к этому катионному пептиду. Анализ BPI-резистентности у E. coli предполагает, что резистентность к BPI-полученным пептидам и другим АР может быть качеством свойственым лишь одним OMPs.

Количество OmpU и OmpТ регулируется фазой роста V. cholerae. Экспрессия toxR была, очевидно, от ранней лог фазы до стационарной фазы в клетках V. cholerae 0395 выращенных при 300 в LB бульоне (рН 6,5). В культуре в середине лог фазы экспрессируется ompU, а оmpТ репрессируется, таким образом, белок OmpТ фактически отсутствует. В эту стадию, toxR клетки проявляют почти в 100 раз большую чувствительность к BPI, чем исходные клетки. Мутанты ompU даже более чувствительны к BPI, чем toxR мутанты. Большая чувствительность ompU мутантов чем оmpТ мутантов может объясняться фактом, что при этих условиях роста, в то время как ompU мутанты не продуцируют OmpU и незначительные количества OmpТ, toxR клетки синтезируют некоторое количество OmpТ (так как облегчается ТoxR опосредованная репрессия транскрипции оmpТ). В клетках стационарно-фазной культуры, OmpТ может также способствовать устойчивости к BPI, хотя ТoxR все еще представлен. Транскрипция оmpТ активируется CRP, который аккумулируется при глюкозолимитированных условиях типичных для стационарной фазы роста. Из этого явствует, что OmpU лучше приспособлен к борьбе с летальным действием BPI, чем OmpТ. Оба – большая изобильность OmpU, чем OmpТ в клетке и отдельные каналы, отвечающие этим поринам могут быть причиной этих различий.

OmpU опосредует устойчивость к другим катионным пептидам кроме BPI пептида. Отсутствие OmpU увеличивает чувствительность V. cholerae в середине лог-фазы к поражению полимиксин В сульфатом почти в 1000 раз относительно исходного типа. Соответственно, штаммы V. cholerae с недостатком OmpU в стационарной фазе, как ранее описано, имеют исходный тип резистентности к полимиксину В нонапептиду. Два возможных объяснения этого противоречия – Provenzano et al. использовали низкие концентрации нонапептидной формы полимиксина В, а мы взамен использовали декапептидную форму, и Provenzano et al. анализировали клетки, отобранные из стационарно-фазной культуры V. cholerae 0395, которой вероятно свойственны высокие уровни резистентности.

Вопрос, почему оmpU мутанты гиперчувствительны к BPI-опосредованному поражающему воздействию, остается без ответа; однако, наша работа парирует гипотезу, что оmpU мутанты имели дефект в наружной мембране. Проницаемость наружной мембраны оmpU клеток очень схожа с таковой исходного типа клеток, как было определено чувствительностью к актиномицину D, также как и гидролизом нитроцефина в отсутствии Р2. Другие наблюдения, которые подтверждают эту идею – нами обнаружено, что человеческий комплемент убивает оба – wt и оmpU клетки в одинаковой степени – альтернативным путем. Комплемент генерирует макромолекулярные поры в наружной мембране, а устойчивость к комплементу может зависеть от некоторых компонентов НМ. Эти данные таким образом согласуются с таковыми Provenzano et al., которые опубликовали, что ompU и ompT мутанты имеют неправильно собранную НМ как определено по эффлюксу периплазматических белков и возможно wt-подобных LPS cтруктур.

Проницаемость НМ ompU и wt клеток схожа, если изменяется как функция времени инкубации с BPI пептидом. Таким образом, по крайней мере, измерением гидролиза нитроцефина в нашей работе предполагало, что BPI опосредует увеличение проницаемости НМ и может быть отделено от цитотоксичности. Это заключение подтверждается схожими данными с E. coli. Не смотря на то, что клетки E. coli с дефицитом OmpR являются чувствительными к разрушающему воздействию rBPI21 (рекомбинантному BPI содержащему аминокислотные остатки от 1 до 193), пептидиндуцируемое изменение проницаемости НМ, проявленное OmpR+ и OmpR- клетками было одинаковым. Факт того, что BPI пептид не поражает tolB и tolA мутантов V. cholerae, которые обладают многочисленными характерными дефектами НМ, сколько-нибудь более эффективно, чем wt клетки подтверждает идею того, что пертурбации НМ могут быть не связаны с клеточной цитотоксичностью.

Если отсутствие определенных поринов не вызывает гиперпроницаемость НМ, тогда возможно имеет место дефектный эффлюкс BPI пептида или неких других субстанций, которые повышают качество цитотоксичности BPI в ompU клетках. Прецеденты возникновения устойчивости вследствие активной утечки АР-подобных протегринов и LL-37 существует у Neisseria gonorrhоeae и Salmonella spp. Эффлюкс поринов у Pseudomonas aeruginosa, которые, как известно, сообщают резистентность к антибиотикам, является наиболее характерным примером порин-опосредованного механизма устойчивости. Не смотря на то, что OmpU и OmpT не имеют хоть какой-нибудь сиквенсной гомологии с этим семейством поринов, вероятно эти НМ порины могут быть вовлечены в активный механизм эффлюкса. Также возможно, что OMPs действуют согласованно с другими эффлюксными белками. Хорошо изученным является НМ эффлюкс канального белка TolC E. coli. Ген vc2436 – близкий гомолог tolC E. coli (70,6% сходства). TolC в V. cholerae N16961 вовлечен в эффлюкс желчных кислот и гидрофобных антибиотиков. Хотя мы обнаружили, что мутант с инсерционной мутацией в tolC у 0395 штамма не показал увеличение чувствительности к Р2 (данные не показаны). Следовательно, TolC не вовлечен в экспорт Р2.

Хотя предполагается, что некоторые катионные пептиды пассируются через НМ с последующим разрушением цитоплазматической мембраны они, по-видимому, неподобны холо-BPI (55 кДа), который может пересекать НМ. Сценарий, по которому взаимодействие BPI пептида с липидом А запускает сигнальный путь, который зависит в некотором отношении от OmpU и OmpT, по-видимому, более вероятен. Мы предполагаем, что пориновая активность OmpU может способствовать клеточному ответу, который повышает цитотоксичность BPI.

Написати коментар


*